《神鬼無間》將故事背景搬到南波士頓，一個警察與愛爾蘭黑手黨長期對立之地。年輕的臥底警察比利寇提根 (李奧納多狄卡皮歐 飾) 被長官指派混入由黑幫老大法蘭克卡斯塔洛 (傑克尼柯遜 飾)所率領的黑道組織裡。正當比利成功打入組織並快速獲得卡老大信任的同時，一名黑道份子柯林蘇利凡 (麥特戴蒙 飾)，也正潛伏在波士頓州立警隊之中，並在素有「菁英小隊」之稱的特別調查組中表現優異而獲得青睞。

兩個臥底棋逢敵手，鬥智鬥力！他們彼此都深陷在自己的雙重身份中，暗中進行埋伏滲透，蒐集對方組織的情報和交易計劃。

當黑道與警察兩邊都發覺有內奸存在，比利和柯林兩人即身處隨時可能因身份曝光而被殺掉的危險邊緣中，為了拯救自己，他們必須先發制人，趕在對方之前，揭發對方的身份。

他們要如何及時揪出敵人以保護自己的身份？是否該為了忠誠而情願反抗自己的朋友與同伴？這是一場充滿考驗的臥底長期抗戰…。